测序结果说明及常见问题解析

首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的 DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。

如果您提供新鲜菌液，请用封口膜封口以免洒漏；也可以将培养好的 4~5 ml 菌液离心沉淀下来，倒去上清液，以方便邮寄。邮寄时最好用盒子，以免运输过程中造成离心管挤压破裂。

溶解 DNA 测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA 的测序反应也是 Taq 酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件；如果 DNA 用缓冲液溶解，测序反应时溶液中的缓冲液组分会改变反应体系条件，造成 Taq 酶的聚合性能下降。

有很多客户使用 TE buffer 溶解 DNA 测序样品。TE buffer 能增加 DNA 样品保存期间的稳定性，对测序反应的影响也较小，但根据我们的经验，还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解 DNA 测序样品。

我们推荐客户提供菌体，由我们提取质粒，这样 DNA 样品比较稳定。

如果您可以提供 DNA 样品，请一定注意样品的纯度、浓度及体积量。如果提供的 DNA 浓度不够，我们需要对质粒进行转化，此时需收取转化费。

提供的测序样品为 PCR 产物时，特别需要注意 DNA 的纯度和体积量：PCR 产物必须进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

有关 DNA 测序样品的详细情况，请严格参照「测序样品的提供」部分的说明。

一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌、甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。

平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌，培养皿在运送过程中常常已经破碎，需要客户重新寄样，既耽误时间，又浪费客户的样品；一旦是非常重要的样品，后果更难以设想。而甘油保存菌则容易污染。

制作穿刺菌时，可在 1.5 ml 离心管中加入琼脂培养基，用牙签把菌体穿刺于固体琼脂培养基中，37 ℃ 培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在 4 ℃ 下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

• 扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
• 必须进行胶回收纯化；
• DNA 纯度（OD260/OD280）在 1.6~2.0 之间，浓度 50 ng/µl 以上。

如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或原来的 PCR 产物去除不干净导致。

大多数所谓的 PCR「纯化试剂盒」实际上只是回收产物，并不能起到纯化的作用：对非特异扩增产物肯定无法去除，而且通常不能完全去除所有 PCR 引物，残留的引物会在测序反应过程中参与反应，导致乱峰。

PCR 产物首先必须用琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切割下来，然后使用凝胶回收试剂盒回收纯化，产物用 ddH₂O 溶解。

• DNA 纯度高，OD260/OD280 在 1.6~2.0 之间，不能有混合模板，也不能含有 RNA、染色体 DNA、蛋白质等；
• 溶于 ddH₂O 中，溶液不能含杂质，如盐类或 EDTA 等螯合剂，否则将干扰测序反应的正常进行。

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入 0.5 µg/ml 的 EB，同时加入一个已知浓度的标准样品；电泳结束后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体 DNA、RNA 等，也可以鉴别抽提的质粒 DNA 的不同构型。

质粒 DNA 的 3 种构型，是指在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状质粒（SC）的一条链断裂，变成开环状（OC）分子；如果两条链都发生断裂，就变成线状（L）分子。这 3 种分子有不同的迁移率：通常超螺旋（SC）迁移速度最快，其次是线状（L）分子，最慢为开环状（OC）分子。

使用紫外分光光度计检测，或者用 EB 标准浓度 DNA 比较法，只能检测抽提产物中的浓度，甚至会因产物中含有 RNA、蛋白质、染色体 DNA 等干扰，使浓度数值没有太多意义。超螺旋的共价闭合环状质粒（SC）也是测序需要的理想标准质粒构型。

• 特异性地与测序模板结合，不能有多于 4 个碱基以上的错配现象；
• 不能含有混合碱基；
• 长度 17~25 个碱基；
• 纯度高，最好 PAGE 纯化；
• 用 ddH₂O 溶解，不要用 TE 缓冲液溶解。

测序引物与待测样品 DNA 分子只能有一个结合位点，这是测序成功的关键。如果测序引物在 DNA 模板分子上有不止一个结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时延伸，反映在测序峰图上就是双峰或乱峰，无法读取序列。

测序用引物的要求非常严格，不同于 PCR 用引物。PCR 用引物一般只要能与模板结合、3′ 端的几个碱基能完全配对，即使引物长达 80~100 多个碱基，只要调整 PCR 反应条件也能成功地进行 PCR 反应；而测序用引物必须严格符合以下要求（本公司测序用引物均使用 Oligo 软件设计，在本公司测序可免费协助设计测序引物）：

• 长度在 15~25 个碱基左右，一般选择 20 个碱基（根据 GC 含量做适当调整），3′ 端尽量选择 G 或 C 碱基（但不绝对），以增加与模板的结合能力；
• Tm 值应选择在 50 ℃~70 ℃ 左右；
• GC 含量应选择在 50% 左右，尽量避开 A、T、G、C 的连续结构；
• 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构；
• 保证引物和模板 100% 匹配，特别是 3′ 端的几个碱基一定要 100% 匹配；同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。

这里分四种情况：

• 的确找不到测序使用的引物序列。目前使用的测序方法是在 ddNTP 上做荧光标记，测序仪通过检测 ddNTP 上的荧光来读取序列；因为引物本身不做荧光标记，所测序列是从引物 3′ 末端之后的第一个碱基开始的，所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是 PCR 产物，想得到 PCR 引物的序列，可以将 PCR 产物双链测通，或者将 PCR 产物克隆到载体上，用载体上的引物测序（注意该引物也不能离插入片段太近）；
• 找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶酶切位点距离测序引物太近，由于荧光染料的干扰，序列开始的部分不会十分准确；
• 插入方向是反的。此时您不妨找一下引物的互补序列；
• 存在单引物扩增。有一条引物的特异性不好、有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。

由于测序仪自身的特点，紧接引物之后的测序信号较弱，一般在测序引物之后数个至数十个（严重时 40~50 个）碱基会读不出来或读错，请引起注意。

众所周知，PCR 扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。

PCR 片段直接测序时，其结果是 PCR 片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，测序时这种错配也就反映不出来了。因此，PCR 片段直接测序的结果反映的是 PCR 用模板最原始的结果。

而 PCR 片段经克隆后测序，是测定了某一个分子的 DNA 序列。在几十个循环的 PCR 扩增过程中，很难保证某一个分子的任何位点都不发生错配。因此，克隆后的测序结果往往存在一些错配序列，与直接测序结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少，取决于 PCR 扩增所用 DNA 聚合酶的保真性能；要减少错配，请选用保真性能高的 DNA 聚合酶。

原因有很多。如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样；如果是 PCR 产物克隆后测序，那还有 PCR 过程中的错配因素等等。

我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致，请理解。

一段基因序列经扩增后克隆到载体中进行测序，在两个层次上可能导致序列发生变化：

• 在 PCR 扩增过程中就可能产生错误，将片段克隆到载体中也有可能发生突变；
• 测序的准确率问题。ABI 公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到 98.5% 以上，由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。

在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到最准确的序列，进行双向测序是很有必要的；只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

ABI 3730xl 测序仪采用 ABI 公司配套的 BigDye Terminator cycle sequencing Kit，其准确性达到 800 个碱基中只有 1 个以下的错误；并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值（Quality Value，QV），根据 QV 值的大小，也可以帮助判断每一个碱基的准确程度。

有的客户想用测序的方法检测点突变体，我们认为该方法的可靠性不高，主要有以下两个原因：

首先，我们并不清楚突变序列与正常序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板量有关，如果突变的模板所占比例很少，将直接作为背景噪音，很难检测出来；只有当测序反应体系中正常模板与突变模板的量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。

其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的，即使突变模板所占比例较高，也不一定能准确检测到突变的存在。

另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描结果进行处理时，会尽量提高主峰、把背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰是背景信号，并在处理过程中进一步压低，这样不利于突变体的检测。因此我们认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于给客户提供一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上，给出的信号往往是比较强的那一个。

所以如果您的 PCR 样品上存在杂合位点，请在测序订单上注明，我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，我们是不会人为将其修改为杂合位点的：出现这种情况，可能是样品中杂合成份太少、信号强度不足以被检测到，也许有其他更加灵敏的检测手段可以满足您的要求。

您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用「3′ 引物」「5′ 引物」这样的字样，因为双方手中的资料在注明方向时可能相反；请以 T7、T3、SP6、M13f、M13r 这样的形式填写，或注明酶切位点方向，例如「测序方向 EcoRI 到 HindIII」。

我们手中的质粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。

出现这样的情况只有两种可能：

• 我们给您的测序结果对应的不是您的样品；
• 您的样品插入部分与您预期的不一致。

作为提供测序服务的一方，我们无法判断测得的序列是否与您预期的结果一致，我们能做的是检查发送给您的测序结果与您提供的样品是否一致。出现这样的问题，我们常规的做法是进行验证实验：取您的原始菌液重新抽提质粒进行测序。验证实验如果在可靠范围内结果与前次不同，说明前次测序结果有问题，前次测序的费用免除；如果结果仍然相同，说明前次测序结果准确，则需要支付验证测序的费用。

给出的全序列是一个拼接的结果。当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更好的为主，这也就是为什么会出现错配，以及全序列与单个测序结果存在差异的原因。

我们在设计引物时有两个准则：一是设计引物区域的序列必须准确，二是在引物区之后必须还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计引物的位置必然比较靠前；在满足软件设定的条件下，我们总会选取最靠近 3′ 端的引物来作为最终的测序引物。

测序是对样品最好的验证。结果为空载，可能的原因如下：

• 可能在培养过程中发生插入片段的丢失，这种情况的发生无法事先预期；
• 提供的克隆是假阳性克隆。

DNA 模板上出现两处以上的引物结合位点，或者 DNA 模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时，测序结果便会出现套峰现象（峰图上会出现很多 N）。

出现这种现象的原因由 DNA 模板本身或引物本身所造成。对这些结果（本公司保证进行 2 次以上的测序工作），我们会根据具体情况进行收费（详见上文「测序结果说明」）。

一般有以下几种原因：

• PCR 用模板不纯，或 PCR 用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的 PCR 产物测序结果就是套峰；
• 结构上的原因。PolyA/G/C/T 以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。

在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结起来有以下几点：

• 测序引物在模板上有两个结合位点，形成套峰；
• 模板不纯：如果是质粒或菌液，原因是非单克隆；如果是 PCR，原因是非特异性条带；
• 模板序列的特殊结构，如 poly 结构、发卡结构等；
• 引物降解、引物不纯，或引物的特异性不好。

如果在 DNA 样品中的序列分布匀称、没有复杂结构，正常的测序反应能保证达到 800 bases 以上。但有一些 DNA 样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。

出现这些现象的原因由 DNA 模板本身所造成（本公司保证进行 2 次以上的测序工作）。对这些结果，我们会根据具体测序情况进行收费（详见上文「测序结果说明」）。原因分析如下：

• G/C rich、G/C cluster：一般表现为测序信号突然减弱或消失；
• A、T 的连续结构：一般表现为 A、T 连续结构后面的测序结果出现套峰。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于 A 或 T 的连续，聚合酶难以识别完整的每一个 A 或 T，从而在某个 A 或 T 的后面便开始对连续结构之后的序列进行聚合（「打滑」现象），造成测序结果紊乱、出现套峰。出现这样的情况，建议反向测序；
• 原因不明的复杂结构：测序结果出现突然的信号减弱或消失，从序列上看 DNA 碱基排列并无特别异常，估计是 DNA 整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶便无法继续聚合。

一般在多少个 A 或 T 的后面能出现这种情况？目前还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现与 A 或 T 连续结构后面的序列排列情况有着直接关系：有时 10 多个 A 或 T 的连续结构后面便出现套峰，但有时 60~70 个 A 或 T 的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来，具体情况还有待考证。

一般来说，PCR 片段直接测序时，A 或 T 连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰，原因在于测序时经历了 PCR 反应及测序反应（测序反应本身也是 PCR 反应）二次聚合酶的打滑现象。

希望您能告诉我们存在疑问的位点的位置。如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验；如果您指出的位点信号清晰准确，仍然要求再进行一次实验，那么实验结果和验证实验是相同的。

PCR 产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性 PCR 扩增产物，是无法用肉眼区分开的；但是 DNA 测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。

需要强调的是，高质量的 PCR 产物才可能得到高质量的测序结果。如果您对 PCR 产物的纯度不很确定，希望您将 PCR 产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。

典型表现：该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。

解决办法：改变 PCR 条件，重新扩增；或者将该 PCR 产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。

碱基缺失常见于 PCR 产物中，特别是从基因组中扩增得到的 PCR 片段。例如某一样品在第 186 位缺失两个连续的 T。

解决方法：

• 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的；或者将该 PCR 产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序；
• 如果可以确定该 PCR 片段中不应该有缺失的位点，可以改变 PCR 反应条件，重新扩增。

引物不纯会造成移码现象。该种现象与模板杂在峰图上都表现为背景峰较杂，但引物不纯在峰图上表现得更有规律：一般在每一个主峰前或者后，都有一个同一碱基的小峰。

解决办法：重新合成引物，或者将引物进行 PAGE 纯化后再进行测序。

重复结构将导致测序移码（读框滑移），重复结构之后的峰型混乱。

解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。

（1）菌液为非单克隆

以 pGEM-T 载体测序结果为例：在第 83 位点处出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。

解决办法：重新挑取单克隆，或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行 PCR 反应或者酶切鉴定，仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一性。

（2）PCR 产物不纯

在 197 bp 之前，测序峰表现为杂峰或明显套峰，且在 197 bp 位置有一个很高的 A 峰；这个 A 峰标志着此 PCR 产物中有一个片段大小为 200 bp 左右的小片段。（注：PCR 产物测序都是以 A 高峰终止。）

解决方法：对 PCR 产物进行切胶纯化，再进行测序。

以 polyT 为例：在 polyA/T 结构之后，往往出现移码、双峰、套峰现象；而在 polyG/C 之后，往往会直接导致测序信号的衰减或者中断。

解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该 poly 结构处，即可完成模板全长的拼接。如果是较长的 polyG/C，建议客户使用 3.0 试剂盒进行测序。

例如某一样品第 94 位至 137 位是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。

解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。

常见原因：（1）产物中含有小片段的 PCR 产物；（2）引物有两个结合位点，其中一个结果中断。

解决方法：更换引物，反向测序。

原因和解决方法同「回文结构」及「插入后双峰」。