引物合成常见问题解答

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目前 oligo DNA 的合成基本都采用固相亚磷酰胺三酯法：将待合成的 DNA 固定在固相载体上，经过脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，逐一将核苷酸单体连接上去，最终完成 DNA 链的合成。此法具有高效、偶联快速、起始反应物比较稳定的优点。

该方法的四个特点：

• 第一个核苷酸通过 3′ 端固定在固相载体（CPG）上
• 每一个核苷酸依次连接上去
• DNA 合成的方向是 3′ → 5′
• 合成在疏水环境中进行

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目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA 合成仪型号很多，主要还是由 ABI/PE 公司生产；无论采用什么机器，合成原理都相同，主要差别在于合成产率的高低、试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

合成方向由待合成引物的 3′ 端向 5′ 端进行，相邻核苷酸通过 3′→5′ 磷酸二酯键连接。一个循环包含四个步骤：

1. 脱保护：将预先连接在固相载体 CPG 上、活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸（TCA）反应，脱去 5′-羟基的保护基团 DMT，获得游离的 5′-羟基。
2. 耦连（缩合）：合成原料亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体。其 3′ 端被活化、5′-羟基仍被 DMT 保护，与固相载体上游离的 5′-羟基发生缩合反应。
3. 加帽（capping）：缩合反应中可能有极少数 5′-羟基没有参加反应（少于 2%），用乙酸酐和 1-甲基咪唑终止其后的继续反应，这类短片段可以在纯化时分离掉。
4. 氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四步，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上；再以三氯乙酸脱去其 5′-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基都被接上去。合成过程中可以通过观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。

循环结束后，通过氨水高温处理把连接在 CPG 上的引物切下来，再经 OPC、PAGE 等手段纯化；成品引物用 C18 浓缩、脱盐、沉淀，沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260 定量，并按订单要求分装。

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所有合成循环结束后，得到的是目标 DNA 片段粗品，须先经过氨解步骤，然后再通过各种方式纯化。氨解包含两个作用：

• 切割：将合成好的寡聚核苷酸从固相载体（CPG）上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水裂解 CPG 上连接化合物与初始核苷之间的酯键。
• 脱保护基：将合成好的寡聚核苷酸上各碱基与磷酸上的保护基脱掉。一般用新鲜浓氨水处理较长时间，以脱去氰乙基（P）、苯甲酰基（dA、dC）、异丁酰基（dG）。

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引物管标签上标注：奥科编号、引物名称、加水量、OD 值、nmol、Tm 值。

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合成得到的粗品必须经过纯化才能用于下游实验，常用方式有四种：C18 柱脱盐、OPC、PAGE 和 HPLC。

PAGE 的回收过程大致为：待目的片段与缺碱基片段分开后，剥离凝胶、切割目的片段、浸泡碎胶，再从泡胶的盐溶液中回收目的 DNA。

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引物常用的纯化方式有 C18 脱盐、OPC 纯化、PAGE 纯化、HPLC 纯化，请根据实验需要确定订购引物的纯度级别。常见应用与推荐级别的对应关系如下：

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实验室方便的作法是用 PAGE 方法：

• 使用加有 7 M 尿素的 16% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
• 取 0.2–0.5 OD 的引物，用尿素饱和液溶解，或在引物溶液中加入尿素干粉直到饱和。
• 上样前加热变性（95 ℃，2 min）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重、便于加样。
• 600 V 电压电泳一定时间（约 2–3 小时）后剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型。主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
• 条件许可时，也可以用 EB 染色或银染方式染色。

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引物不纯可能导致：

1. 非特异性扩增；
2. 无法用预先设计在引物 5′ 端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；
3. 用于测序出现双峰或乱峰。

解决办法是重新合成或重新纯化。

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引物 OD 数的测定方法：用紫外分光光度计，波长 260 nm，石英比色杯，光程 1 cm，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2–1.0 之间。

DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取 1 mL 水稀释测定 OD 值，再根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。

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引物保存在高浓度状况下比较稳定，一般配制成 10–50 pmol/μL。溶解前请核对合成报告单和引物标签上的 OD 数是否一致；如果不一致，请与我们联系，我们可以根据生产记录查到实际产量。

一般情况下，建议将引物配制成 50 pmol/μL，加水的体积（μL）按下列方式计算：

V（μL）= OD 数 × 33 × 20000 / 引物的分子量

引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260 = 33 μg/mL。

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根据实验目的确定：

• 一般 PCR 扩增：2 OD 引物可以做 200–500 次 50 μL 标准 PCR 反应。
• 基因拼接，或退火后做连接：1 OD 通常就足够。
• 全基因构建：所用引物一般较长，片段越长，全长产物得率越低、出错几率越大，建议按实际需要订购。

只做几次 PCR 却订购 5–10 OD，用量上并不经济；超出实际需要的 OD 数要求也会造成不必要的浪费。

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引物设计软件都可以给出 Tm 值，它与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲液的离子强度有关。

长度为 25 bp 以下的引物，Tm 计算公式为：

Tm = 4 ℃ ×（G + C）+ 2 ℃ ×（A + T）

对于更长的寡聚核苷酸，Tm 计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 × log10[Na+] + 0.41 ×（%GC）− 600 / size

公式中，size 为引物长度。

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非修饰引物的分子量（Molecular Weight）在随引物提供的报告单上都有明确标示。如需估算，可按每个碱基的平均分子量 324.5 计算：

引物分子量 = 碱基数 × 324.5

精确计算可按下列公式：

MW =（NA × WA）+（NC × WC）+（NG × WG）+（NT × WT）+（Nmod × Wmod）+（Nx × Wx）+（Ni × Wi）+ 16 × Ns − 62

其中 NA、NG、NC、NT、Ni 分别为引物中碱基 A、G、C、T、I 的数量，WA、WC、WG、WT、Wi 分别为对应碱基的分子量，Nmod、Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

混合碱基的分子量为混合碱基分子量之和除以混合数，例如 G/A 混合的分子量为 (313.21 + 329.21) / 2 = 321.21。Ns 为硫代修饰的数目，每个硫代位置增加分子量 16。

常规碱基分子量：

常规修饰基团分子量：

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经常有客户问：引物应该全是 DNA，OD260/OD280 的比值为什么那么低，是不是有蛋白质污染？

需要说明的是，OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。引物是化学合成的，不存在污染蛋白质的机会；比值偏低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 20-mer 同聚体引物的 OD260/OD280 比值，清楚表明该比值与引物的碱基组成密切相关：

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通常可以用 EB 染色的方法来判断双链 DNA 的量（如质粒 DNA），因为 EB 可以嵌合到双链 DNA 中。而合成的单链 DNA 由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB 的染色程度也会有差异——比如 Oligo（dT）几乎不形成二级结构，EB 染色效果就非常差。

所以不要用 EB 染色的方法来定量，而应用紫外分光光度计检测。同样道理，用 EB 染色来拍照不适合所有引物。

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干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或将管垂直向上在桌面上敲敲，把引物粉末收集到管底。按计算出的体积加入去离子无菌水或 10 mM Tris（pH 7.5）缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，再离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（pH 4–5），引物在这种条件下不稳定。

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引物合成后经一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。溶解前，引物在室温状态下可以长期保存；溶解后的引物在 −20 ℃ 可以长期保存。

如果对实验的重复性要求较高、合成的 OD 数较大，建议分装保存，避免反复冻融。荧光修饰引物需要避光保存。

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常见原因有三类：

• 溶解引物的水 pH 过低，或污染了细菌、核酸酶，使引物降解。
• 使用时没有充分解冻混合，液体不均匀，造成引物加入量不准确。
• 引物本身没有问题，而是 PCR 所用材料（特别是模板）的质量与先前使用的不完全一致。

建议分装引物、避免反复冻融，并使用 10 mM Tris（pH 7.5）缓冲液溶解引物。

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引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过 120 base 的引物，但产率很低。

除非确有需要，建议合成片段长度不要超过 80 mer。按照目前的引物合成效率，80 mer 的粗产品中全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过 40%，后续处理还会丢失很多，最后产量很低。

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引物合成时，每一步反应的效率都不能达到 100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素一直客观存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。

如同 PCR 扩增不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证 100% 正确。实际上，引物合成中（非人为因素）发生错误的频率，比任何高保真热稳定聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。因此做长链引物合成，需要对「部分引物可能存在突变」有思想准备。

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测序发现引物区域有突变，特别是 40 个碱基以下的引物，发生的概率不大，但确实也会发生。引物序列一般是由电脑直接拷贝到合成仪的，碱基输错的机会不多，我们也有相应的控制办法来预防碱基输入错误。

引物合成的固相合成原理都一样，各家采用的机器也基本相同，合成所需的主要原料由少数几家跨国公司提供，因此各家合成服务商遇到的问题也基本类似。

三类突变的可能原因

• 插入突变：常表现为碱基重复。一般认为，偶联过程中正在偶联的部分单体丢失 DMT，导致单体又接了上去，从而插入同一碱基。
• 缺失突变：一般认为由加帽（capping）反应不彻底造成。加帽反应主要用于封闭极少数没有参与反应的 5′-羟基；被封闭的引物在下一轮偶联时不能继续参与合成。
• 置换突变：一般认为是碱基不能 100% 脱保护，引物上残留保护基团的区域不能很好地与互补链配对；扩增产物被亚克隆转化到大肠杆菌后，可能被细菌的修复系统补上非配对的碱基。

置换突变通常表现为 G 转换为其他碱基：碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），DNA 复制和扩增过程中聚合酶将 2,6-diaminopurine 看作碱基 A，测序就会发现 G→A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生频率较高；脱嘌呤的引物如果在后处理脱保护阶段被降解，测序则表现为 G 或 A 的缺失。

引物合成是多步骤的化学反应，合成效率最高也就是 99%，副产物不可避免。造成碱基插入、缺失、置换突变的因素客观存在，也有不少降低发生频率的建议和措施，但这些措施还停留在实验室阶段，尚不能应用于规模化生产。

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遇到这种情况，请首先与我们联系。生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否与订单一致——我们在电脑中保留所有原始数据。

如果确认引物合成序列没有输错，建议重新挑取克隆测序，通常可以找到正确的克隆：

• 40 个碱基以下的引物：测 1–2 个克隆就可以了；
• 40 个碱基以上、特别是用于全片段拼接合成的引物：需要多测一些。

一般情况下，每个克隆的突变位点都不一样，提示正确序列的克隆总是存在的，关键是如何把它找出来。

您也可以要求我们将引物免费重新合成一次。不过重新合成的引物与第一次一样，都可能含有突变，并不会因为重新合成而降低您遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现某段区域突变点不多，就多测几个克隆；否则可以重新合成引物。

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理论上，分析型 PAGE 变性电泳可以区分引物之间一个碱基的差别。但制备型 PAGE 电泳的上样量非常大，电泳时的条带很宽，带与带之间有重叠，分辨率已经下降；电泳后割胶回收目的引物时，很难保证完全没有割到仅相差几个碱基的引物。

此外，PAGE 纯化引物（特别是长引物）的订购量往往较高，需要割取的条带有时也会更宽。建议：适当减少订购的 OD 数，遇到问题的概率也会随之降低。

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合成的引物与您的订单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

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合成的引物 5′ 端为羟基，没有磷酸基团。如果需要，您可以用多核苷酸激酶（PNK）进行 5′ 端磷酸化。

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连接反应需要引物的 5′ 磷酸基团。如果需要将合成的引物退火后直接连接到相应载体上，引物需要先磷酸化。

如果磷酸化的产物仍不能连接到载体上，需要检查载体的酶切效果，并改善引物退火的条件。siRNA 分子具有特殊的对称结构，退火难度较大，退火时需要提高退火温度。

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我们合成的引物两端都是羟基。如果想把扩增产物直接连接载体，需要先做引物磷酸化。

磷酸化后仍不能连接，请检查载体的酶切效果，并改善引物退火的条件。

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PCR 扩增不成功的因素很多，需要耐心分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑是引物的问题，请先测定已溶解引物的 OD 值，确认实验中加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请提供引物编号，我们会复查留存样品；如仍不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果依旧不能扩增，请您查找其他原因。

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基本不是。如今发展了各色各样的 PCR 扩增技术和热稳定聚合酶，正是为了解决扩增不出、扩增效率低的问题——例如巢式 PCR 就是用来扩增拷贝数很低的基因片段的；重复序列片段、GC 含量高的片段，往往需要特殊的扩增手段才能扩增出来。

引物扩增不出，以下两种情况比较常见：

1. RT-PCR：很多基因通过常规 RT-PCR 方法很难扩增出来。RT-PCR 成功的关键在于 RT 反应所用 RNA 的质量，以及目标基因在特定组织和细胞中的含量。
2. 从基因组中扩增：基因在基因组中一般为单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组 DNA 量过高，会影响反应体系中的 Mg²⁺ 和 pH。

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不能这样判断。扩增目标很弱或没有、非特异性条带却很亮时，用户容易认为引物不纯或有污染。但我们分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两端至少可以找到一条引物序列。

因此，非特异性扩增一般是模板污染（如 RNA 中污染了基因组）或扩增条件不合适所致。